물벼룩을 이용한 급성 독성 시험법(Feat. 생태독성)

시약

배양액 및 희석수

※ pH 7.6~8.0, 경도 (160~180) mg CaCO3/L, 알칼리도 (110~120) mg CaCO3/L, 용존산소 3.0 mg/L 이상 유지, 사용 전 24시간 정도 폭기

시약	첨가량(mg/L)
염화칼륨(KCl) 황산마그네슘(MgSO4) 황산칼슘 이수화물(CaSO4∙2H2O) 탄산수소나트륨(NaHCO3)	8 120 120 192

 

시험생물

1. 시험생물은 물벼룩인 Daphnia magna Straus를 사용하도록 하며, 출처가 명확하고 건강한 개체 사용
2. 시험 실시 시, 계대배양한 생후 2주 이상의 물벼룩 암컷 생체의 생후 24시간 미만 어린 개체 사용
3. 시험하기 2시간 전 먹이를 충분히 공급하여 시험 중 먹이가 주는 영향 최소화
4. 먹이는  Chlorella sp., Pseudokirchneriella subcapitata등과 같은 녹조류와 yeast, Cerophyll(R), trout chow의 혼합액인 YCT를 사용
5. 물벼룩 폐기 시 망으로 걸러 살아있는 상태로 하수구에 유입되지 않도록 주의
6. 하루에 배양 용기 내 전체 물벼룩 수의 10% 이상 치사한 경우 어미개체를 폐기하고, 어린 물벼룩은 시험생물로 사용하지 않음

실험방법

시료의 희석비는 원수 100%를 기준으로 50, 25, 12.5, 6.25 %로 시험

↓

한 농도 당 시험생물 5마리씩 4개의 반복구를 둠

시험용액의 양은 50mL

↓

시험시간 동안 조명은 명 : 암 = 16 : 8 시간 유지

물 교환, 먹이공급, 폭기 X

                                       ↓ 온도(20±2)℃ 24시간 후

유영저해 및 치사여부 관찰 후 EC50 값 산출

 

 

계산식

통계적 방법을 통한 EC50 값을 구할 수 있는 경우

생태독성값(TU) = 100/EC50

 

통계적 방법을 통한 EC50 값을 구할 수 없는 경우

100 % 시료에서 투입 물벼룩의 (0~10)% 가 영향을 받는 경우

TU = 0

 

100 % 시료에서 투입 물벼룩의 (10~49)% 가 영향을 받는 경우

TU = 0.02 X (유영저해율 또는 치사율)

 

100 % 시료에서 투입 물벼룩의 (51~99)% 가 영향을 받는 경우

필요에 따라 100 % 와 50 % 사이에 시료 희석비 추가하여 재시험

 

6.25 % 시료에서 투입 물벼룩의 50 %를 초과가 영향을 받는 경우

TU > 16으로 표기

 

QA/QC

표준독성물질 시험

표준독성물질 시험은 배양액에 24시간-EC50 값이 (0.9 ~ 2.1) mg/L 범위가 되도록 다이크롬산포타슘을 첨가한 표준독성물질 용액을 이용하여 시험

※ 24시간-EC50 값이 (0.9 ~ 2.1) mg/L 범위 밖으로 나왔다면 재시험하고, 재시험 결과에서도 범위 밖으로 나왔다면 물벼룩을 전량 폐기 후 새로운 개체 재분양

• 표준독성물질 시험은 월 1회 이상 수행하여야 하며, 이를 내부정도관리차트(control chart)로써 작성

 

공정시험기준 외 물벼룩 배양방법

수조교체

1. 1L 비커 수조에 성체 12~15마리씩 배양
2. 이틀에 한번(월, 수, 금) 씩 새로운 수조로 교체  → 시료 인계 날짜에 따라 유동적으로 변경이 가능하나, 수조 교체 주기를 바꾸기보다는 계대배양을 하지 않는 날에는 새끼만 따로 뽑아 분석에 사용
3. 월요일마다 새끼수조 생성 → 어미개체의 부화주기는 6일 정도로 홀수 주는 월요일, 짝수 주는 수요일에 새끼수조를 생성해 주면 새끼의 개체 수를 안정적으로 관리할 수 있음
4. 배양 후 9일 차에 수컷 성체 분리하여 폐기 → 수컷의 부화 시, 폐기해야 내구란이 생기지 않음. 부화 후 9일 차부터 수컷과 암컷이 육안으로 확인 가능

 

배양액 조제

1. 배양액 조제는 위의 시약에 따라 조제하고, 관리함
2. 월, 수, 금 수조교체 기준으로 화, 금에 배양액 조제
3. 황산칼슘 이수화물은 잘 녹지 않아 따로 녹여 혼합함
4. 금요일을 제외하고, 배양액의 24시간 폭기는 꼭 지켜줌 → 과폭기는 경도를 높여 알칼리성이 될 수 있음